（一）“一種利用qPCR精確定量不同GC含量的二代測序文庫的方法及試劑盒”

            2019年08月13日，全式金獲此項(xiàng)專利授權(quán)，專利號:ZL201610864592.0。

 本發(fā)明公開了一種利用qPCR精確定量不同GC含量的二代測序文庫的方法及試劑盒。首先提供了利用qPCR精確定量不同GC含量的二代測序文庫的試劑盒，包含：多個不同GC含量的標(biāo)準(zhǔn)品，文庫稀釋液，qPCR預(yù)混液，引物，ddH₂O。還提供了利用上述試劑盒進(jìn)行qPCR精確定量不同GC含量的二代測序文庫的方法。本發(fā)明試劑盒和方法定量精確、使用方便、適用范圍廣、選擇性強(qiáng)、靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性好，為高質(zhì)量高效率的測序提供了保證。

 我公司應(yīng)用此專利技術(shù)自主研發(fā)的定量試劑盒“TransNGS^? Library Quantification Kit for Illumina （KQ101）” 特點(diǎn)：

 · 線性標(biāo)準(zhǔn)品，定量更精確。

 · 選擇性強(qiáng)、定量更精確，精心設(shè)計(jì)多種不同GC 含量的標(biāo)準(zhǔn)品。

 · 特異性強(qiáng)，只擴(kuò)增雙端接頭完整的文庫分子。

 · 操作簡便，直接使用預(yù)先稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品，包含絕對定量所有必需組分。

 · 擴(kuò)增效率與靈敏度高，特別優(yōu)化的qPCR 體系與程序。

 · 適用范圍廣，可擴(kuò)增AT/GC 含量高的模板。

 · 兼容性好，兼容所有主流qPCR 儀器。

 · 穩(wěn)定性好，重復(fù)性好。

（1）產(chǎn)品穩(wěn)定性

 分別使用不同批次產(chǎn)品進(jìn)行qPCR 檢測，結(jié)果顯示，4 個批次的標(biāo)準(zhǔn)品(S6-S1) 的Ct 值均無明顯差異，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程非常穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)品批次間穩(wěn)定性非常好。

（2）與主流產(chǎn)品的對比

 分別使用TransGen、K 公司、N 公司及V 公司產(chǎn)品對6 個不同物種的文庫進(jìn)行定量，結(jié)果顯示，TransGen 與K 公司對6 個文庫定量結(jié)果無明顯差異，而其它兩種產(chǎn)品結(jié)果明顯偏高或偏低，TransGen 產(chǎn)品定量結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)K 公司產(chǎn)品定量結(jié)果一致。

（3）產(chǎn)品極限數(shù)據(jù)

分別使用TransGen 及K 公司產(chǎn)品對6 個差異明顯的文庫進(jìn)行定量，結(jié)果顯示，TransGen 對不同種屬文庫、不同GC含量、不同長度、不同濃度的文庫都可以精確檢測，與金標(biāo)準(zhǔn)K 公司一致，這說明產(chǎn)品適用范圍廣。文庫檢測合格后，按照文庫定量結(jié)果將相同量的不同文庫Pooling 至同一條Lane 后進(jìn)行Illumina HiSeq 測序，數(shù)據(jù)分析顯示，NGS 能獲得預(yù)期量的clean reads, 并且根據(jù)TransGen 與K 公司定量結(jié)果所獲得的數(shù)據(jù)量無明顯差異。

 分別使用TransGen 與K 公司文庫定量產(chǎn)品對5 種同一濃度的不同GC 含量（25%、37.5%、50%、62.5%、75%）的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行qPCR 檢測，結(jié)果顯示，不同GC 含量的標(biāo)準(zhǔn)品的Ct 值差異小，都可很好地?cái)U(kuò)增。表明TransGen 產(chǎn)品適用范圍廣，與金標(biāo)準(zhǔn)K 公司產(chǎn)品相當(dāng)。

（4）產(chǎn)品特色與優(yōu)勢

 · 精心設(shè)計(jì)5 種不同GC 含量的線性標(biāo)準(zhǔn)品，選擇性更強(qiáng)，定量更精確。

 分別使用5 種不同GC 含量（25%、37.5%、50%、62.5%、75%）的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量天藍(lán)色鏈霉菌（左，72%GC）與擬南芥（右，36% GC）這兩個DNA 文庫的濃度，結(jié)果顯示，不同GC 含量標(biāo)準(zhǔn)品定量結(jié)果差異明顯。如果以50% GC Standards 作為標(biāo)準(zhǔn)品，其定量結(jié)果明顯會相對偏小(p 值都小于0.001，n=4)。因此，天藍(lán)色鏈霉菌的DNA文庫應(yīng)該選擇75% GC Standards 而擬南芥則選擇37.5% GC Standards 分別作為其最佳標(biāo)準(zhǔn)品，文庫定量結(jié)果會更加精確，確保獲取更高質(zhì)量的測序結(jié)果。

 （二）“一種適用于高效反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄引物組合”

            2019年08月13日，全式金獲此項(xiàng)專利授權(quán)，專利號：ZL201710031139.6。

 本發(fā)明公開了一種適用于高效反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄引物組合，所述反轉(zhuǎn)錄引物組合由帶有oligo(dT)結(jié)構(gòu)的引物和半隨機(jī)引物組成，還公開了所述反轉(zhuǎn)錄引物在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的應(yīng)用。本發(fā)明反轉(zhuǎn)錄引物組合在保留了錨定引物優(yōu)勢的同時，避免了普通隨機(jī)引物所引起的堿基錯配和非隨機(jī)配對，消除傳統(tǒng)反轉(zhuǎn)錄引物對于mRNA模板5’端、3’端的合成效率偏好性，使mRNA模板各位點(diǎn)能夠均勻、無差錯地合成到相對應(yīng)的cDNA中，從而顯著提升反轉(zhuǎn)錄效率與數(shù)據(jù)均一性、穩(wěn)定性。

 除一步法外，Trans RT系列產(chǎn)品均配有Anchored Oligo（dT），結(jié)合位點(diǎn)鉚釘，特異性高，跨越Poly（A）+結(jié)構(gòu)，保證cDNA合成效率和成功率。

 在此我們要重點(diǎn)介紹一下我司的反轉(zhuǎn)錄All-in-One系列產(chǎn)品:

 1)TransScript^? All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR（AT321）；

 2)TransScript^? II All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR（AH321）；

 這兩款產(chǎn)品含有反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所需的全部試劑，只需加入模板RNA和RNase-free water即可反應(yīng)。最大程度地簡化了操作步驟, 降低了污染幾率；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)僅需30min；最佳Anchored Oligo(dT) Primer和Random Primer(N9)配比，長鏈cDNA合成效率高；兩款產(chǎn)品反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物適用于PCR（也可用于qPCR）。

 ·TransScript^? All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR合成長度，TransScript≤12kb；

 ·TransScript^? II All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR合成長度， TransScriptⅡ≤15kb；高熱穩(wěn)定性：反應(yīng)溫度42℃-55℃，最佳反應(yīng)溫度為50℃；適用于高拷貝、低拷貝基因檢測；突出高GC含量或具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的RNA模板。

 3)TransScript^? All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal）（AT341）；

 4)TransScript^? II All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal）（AH341）。

 這兩款產(chǎn)品含有反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所需的全部試劑，只需加入gDNA Remover，模板RNA和RNase free water即可反應(yīng)。最大程度地簡化了操作步驟, 降低了污染幾率；整個反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)僅需15 min；由最佳的Anchored Oligo(dT) Primer和Random Primer(N9)配比，及優(yōu)化的SuperMix組成，確保對不同濃度的RNA有相同的反轉(zhuǎn)錄效率，短鏈cDNA合成效率高；該Mix中含有gDNA Remover組分，在同一反應(yīng)管中，同時完成反轉(zhuǎn)錄與基因組DNA的去除，降低污染幾率，保證后續(xù)qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加理想。

 兩項(xiàng)發(fā)明專利的同時授權(quán)既是我公司的榮譽(yù)，也是對我公司技術(shù)水平的肯定，全式金將繼續(xù)堅(jiān)持自主研發(fā)、創(chuàng)新的發(fā)展模式，為廣大客戶朋友們提供高性價比的產(chǎn)品，助力生命科學(xué)的研究和發(fā)展。