Q：不酶切或酶切不完全

A:

? 酶失活或濃度過(guò)低：用已知含目的酶切位點(diǎn)的對(duì)照 DNA 測(cè)試該酶活性；酶應(yīng)貯存于 -20℃，-70℃時(shí)會(huì)凍結(jié)；避免反復(fù)凍融降低酶活；可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求適當(dāng)加大酶

量。

? DNA 濃度不合適：推薦 50 μl 反應(yīng)體系酶切 1-2 μg DNA；DNA 過(guò)量時(shí)可適當(dāng)增加酶量。

? DNA 被抑制劑污染：與對(duì)照 DNA 樣品一起酶切，驗(yàn)證其是否被抑制；重新純化 DNA 樣品。

? DNA 可能形成超螺旋：不同酶對(duì)超螺旋結(jié)構(gòu) DNA 消化效率不一樣，可適當(dāng)加大酶量。

? 識(shí)別位點(diǎn)過(guò)于接近 DNA 末端：一般在識(shí)別位點(diǎn)兩端各加 6 個(gè)保護(hù)堿基可確保酶切效率。

? 識(shí)別位點(diǎn)不存在：驗(yàn)證 DNA 序列。

? 反應(yīng)條件非最優(yōu)化：緩沖液使用不當(dāng)；按比例使用新鮮緩沖液重復(fù)實(shí)驗(yàn)；按照推薦方案進(jìn)行雙酶切或分步酶切。

? 甲基化封閉酶切位點(diǎn)：PCR 產(chǎn)物未甲基化；使用 dam-/dcm-菌株轉(zhuǎn)化。

Q：出現(xiàn)非預(yù)期帶型

A：

? 確定正確帶型：酶切產(chǎn)物與對(duì)照 DNA 樣品一起電泳，確定是未消化完的底物條帶或者是星號(hào)活性產(chǎn)生的非預(yù)期條帶。

? DNA 樣品污染：重新制備或純化樣品

? 含其它酶切位點(diǎn)：驗(yàn)證 DNA 序列

Q：DNA 電泳呈彌散帶

A：

? 酶與 DNA 結(jié)合緊密未完全解離：使用隨酶提供的 DNA Loading Buffer 上樣電泳；或另加入終濃度為0.05-0.2% 的 SDS。

? 核酸酶污染：制備新的底物樣品；使用新的緩沖液和水。

? 電泳條件不合適：使用新鮮的電泳緩沖液和凝膠；合適的電流電壓避免過(guò)熱。

Q：星號(hào)活性 (特異性降低或改變)

A：

? 高甘油濃度 (>5% v/v)：酶儲(chǔ)存液含 50% 甘油；因此酶量不超過(guò)反應(yīng)體積的10%。選擇 50 μl的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系，以減少反應(yīng)過(guò)程中水的蒸發(fā)而提高甘油濃度。

? 非最適緩沖液：盡可能使用推薦緩沖液，離子濃度和 pH 的改變會(huì)引起星號(hào)活性。

? 存在有機(jī)溶劑 ( 如 DMSO、乙醇、DMF 等)：確保樣品在制備過(guò)程中不含任何有機(jī)物，如 DNA 制備過(guò)程中可能混入的乙醇。

? 混有其它二價(jià)離子 (如 Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+) 去除樣品中二價(jià)離子