Q：如何選擇合適的克隆載體？

A：Taq系列酶擴增的片段，選用T載體；Pfu系列酶擴增片段，選用Blunt系列載體，也可以加“A”后和T載體連接，但效果不如直接連接Blunt系列載體。如果PCR模板是質粒DNA，推薦使用雙抗性載體。

Q：插入片段的量多少合適？

A：

? 片段加入量可根據(jù)片段長度不同進行調整。 最佳插入片段DNA量：載體與片段摩爾比=1:7

? 可以粗略的按照“1 kb 20 ng”的比例計算。(如1 kb加20 ng，1.5 kb加30 ng等)、(在膠上通過TransGen的DNA 分子量標準粗定量即可)

? 片段加入量最大為4μl，即使片段濃度很低也不要超過此限。片段加入量最少為0.5μl，可以補充無菌水以方便操作。

? 反應溫度范圍：20-37℃，最適反應溫度為25℃。

Q：反應時間多長合適？

A：

? 大多數(shù)1 kb以內的PCR產(chǎn)物室溫反應5分鐘即可完成反應。以下幾種情況可以延長反應時間以獲得更理想的效果：

? 具有特殊結構(高AT/高GC/反向重復序列)的片段：10-20分鐘。

? 膠回收片段或加"A"片段：10-15分鐘(該條件適用于3 kb以內的片段)。

? 大于3 kb的PCR產(chǎn)物需延長至15-20分鐘。

Q：連接產(chǎn)物可以保存多久？

A：連接產(chǎn)物可以置于-20℃或2-8℃冰箱，一周內使用。

Q：多克隆位點上的酶切位點切不開？

A：篩選到的克隆來源于模板質粒而不是連接產(chǎn)物。推薦使用雙抗載體，篩選時使用模板質粒不具有的抗性。

Q：克隆數(shù)少或陽性率低？

A：

? 影響克隆數(shù)目和克隆效率的因素有許多，如感受態(tài)細胞效率、插入片段質量、基因結構、插入片段長度、插入片段和載體的比例等。如發(fā)現(xiàn)克隆數(shù)少或克隆效率低，可嘗試下列方法：

? 感受態(tài)細胞的轉化效率對克隆數(shù)有重要影響，轉化效率高低與連接產(chǎn)物克隆數(shù)的多少不呈線性關系。假設細胞轉化效率為1×109 cfu/μg DNA時，克隆數(shù)為1000；轉化效率為1×108 cfu/μg DNA時，克隆數(shù)并不是100，而是低于100。為保證克隆數(shù)，請選用高轉化效率的Trans1-T1感受態(tài)細胞。

? 使用新鮮的PCR產(chǎn)物：PCR產(chǎn)物于2-8℃保存，1-2天內使用。對于膠回收產(chǎn)物，應盡量縮短紫外照射時間并適當延長反應時間 (10-15分鐘)。

? 目的片段濃度極低時，進行濃縮，以保證反應時分子碰撞機率。

? 毒基因：使用Trans10感受態(tài)細胞。

? 具有特殊結構 (高AT/高GC/反向重復序列) 的基因：適當延長反應時間至10-20分鐘。

Q：PCR鑒定重組子失??？

A：當用通用引物鑒定重組子，沒有得到目的擴增產(chǎn)物，又沒有載體自連帶，說明PCR失敗。重新優(yōu)化PCR條件或提取質粒，以質粒作模板擴增或酶切鑒定包含重組子的克隆。

Q：重組克隆呈現(xiàn)淡藍色或“Fish eye”？

A：插入片段沒有影響LacZ基因讀碼框，或插入片段太短 ，這種情況下克隆呈現(xiàn)淡藍色或“Fish eye”，可正常鑒定。